Skip to content

Mutacje w TERT, gen odwrotnej transkryptazy telomerazowej, w niedokrwistości aplastycznej cd

2 tygodnie ago

526 words

. . oraz inne ważne klasy wariantów genetycznych o potencjalnym znaczeniu dla badań epidemiologii molekularnej raka i innych chorób. 27 próbek od dodatkowych 246 anonimowych zdrowych osób pochodzenia latynoskiego (52 procent Peruwiańczyków, 28 procent mieszkańców Ameryki Łacińskiej i 20 procent Indian Pima i Maya) ) zostały również zbadane jako kontrole. W sumie 1056 chromosomów z czterech głównych grup etnicznych stanowiły grupę kontrolną. Mutacyjna analiza
Amplifikacja łańcuchów reakcja polimerazy (PCR) genów kodujących kompleks telomerazy – mianowicie DKC1, NOP10, NHP2 i TERT – została przeprowadzona z użyciem próbek DNA wyekstrahowanych z komórek krwi obwodowej lub szpiku kostnego, jak opisano wcześniej.25 Startery i PCR warunki są wymienione w Tabeli Dodatku Dodatkowego (dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org). Produkty PCR oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick PCR purification kit (Qiagen), a bezpośrednie sekwencjonowanie przeprowadzono z użyciem BigDye Terminator wersja 3.1 (Applied Biosystems). Zaprojektowano specyficzne startery do sekwencjonowania (Tabela 2 Dodatkowego Dodatku), a produkty sekwencjonowania analizowano w zautomatyzowanym analizatorze sekwencji genetycznej (ABI Prism 3100, Applied Biosystems). Wszystkie sekwencje określono w obu kierunkach, a mutacje potwierdzono trzema odrębnymi produktami amplifikacji PCR.
Aby ocenić mikrodelecję lub mikroinsercję, produkty PCR wstawiono bezpośrednio do wektora pCR2.1-TOPO i transformowano do kompetentnej Escherichia coli (szczep TOP10F.) Za pomocą zestawu do klonowania TOPO TA (Invitrogen). Pacjenci wcześniej przeszli badania przesiewowe pod kątem mutacji TERC, jak opisano w innym miejscu, 25 i tych pozytywnych pod względem mutacji wykluczono z analizy.
Analiza funkcjonalna
Średnią długość powtórzeń telomerów na końcach chromosomu w poszczególnych leukocytach krwi obwodowej mierzono metodą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ metodą fluorescencji in situ28. Aktywność telomerazy aktywowanych komórek T oceniano przez protokół amplifikacji telomerowej z detekcją Telomerase TRAPeze. zestaw (Chemicon) w komórkach od pacjentów i krewnych niosących mutacje w kodonie 202 lub 1090 (komórki od nosicieli mutacji w kodonie 412, 694 lub 772 nie były dostępne). Komórki krwi obwodowej hodowano w RPMI 1640 z L-glutaminą i 10% surowicą płodową cielęcą w obecności fitohemaglutyniny (5 .g na mililitr) i interleukiny-2 (40 IU na mililitr) przez cztery dni w 37 ° C z 5 procent dwutlenku węgla. Próbkę wybarwiono anty-CD3 i anty-CD4-fikoerytryną (BD Biosciences) w celu analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie w cytometrze przepływowym LSR II (BD Biosciences). Analizy cyklu komórkowego i analizy DNA-ploidalności przeprowadzono za pomocą zestawu NuCycl (Exalpha), zgodnie z instrukcjami producenta. Białko wyekstrahowano i aktywność telomerazy oznaczono zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami, jak opisano wcześniej.
Mutacje wprowadzono do plazmidu pcI-TERT przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej miejscowo (Stratagene) i zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Dwa mikrogramy DNA typu dzikiego lub zmutowanego pcl-TERT transfekowano do komórek VA13 + TERC z niedoborem telomerazy (przy 60% konfluencji), jak opisano wcześniej29. VA13 + TERC jest linią fibroblastów ludzkich płuc, które nie wyrażają ekspresji. aktywność telomerazy, z powodu braku ekspresji TERT; zamiast tego komórki przyjmują alternatywny mechanizm utrzymania telomerów, ALT (alternatywne wydłużanie telomerów). 30 W badaniach kotransfekcji do komórek VA13-TERC zastosowano dwa stosunki typu dzikiego do zmutowanego DNA pcI-TERT: .g do .g lub .g do 3 .g, odpowiednio, odpowiednio, 2 .g lub 4 .g
[więcej w: hematopoeza, grecki nos, martwica balsera ]
[hasła pokrewne: zawał krezki, rezonans magnetyczny gdynia, jejunostomia ]