Skip to content

Mutacje w TERT, gen odwrotnej transkryptazy telomerazowej, w niedokrwistości aplastycznej ad 6

3 tygodnie ago

470 words

Ponadto obserwowane częstości alleli dla dwóch niesynonimicznych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów były podobne u pacjentów z niedokrwistością aplastyczną i kontrolnymi (Tabela 1). Aktywność telomerazowa komórek hodowlanych
Rysunek 2. Rysunek 2. Analiza funkcjonalna mutacji TERT. Panel A pokazuje aktywność enzymatyczną telomerazy (mierzoną w teście amplifikacji telomerycznej) w lizatach wykonanych z pierwotnych komórek T zebranych od dwóch pacjentów, którzy są heterozygotyczni pod względem mutacji TERT; całkowite stężenia białka w lizatach komórkowych w każdej próbce wynosiły 1,0 .g, 0,5 .g i 0,1 .g. Próbki od osób zdrowych zastosowano jako kontrole pozytywne. Komórki te ekspandowano w hodowli tkankowej w takich samych warunkach jak te stosowane w próbkach związanych z chorobą. Eksperymenty powtarzano co najmniej dwa razy. Symbol minus oznacza dezaktywowaną termicznie rybonukleoproteinę telomerazy dodatniej próby kontrolnej o stężeniu .g; symbol plus wskazuje pozytywną kontrolę łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z matrycą DNA zawierającą sztuczne telomerowe powtórzenia dostarczone w zestawie do detekcji telomerazy. IC oznacza produkty PCR amplifikowane z matrycy DNA stosowanej jako kontrola wewnętrzna dla skuteczności amplifikacji PCR w każdej reakcji. Panel B pokazuje wyniki powtórzeń amplifikacji telomerowych powtórzeń lizatów komórkowych wykonanych z rekonstytucji zmutowanych wektorów ekspresyjnych TERT (2 .g na reakcję transfekcji) w linii komórkowej VA13 + TERC z ekspresją telomerazy, która normalnie eksprymuje tylko składnik RNA TERC rybonukleoproteina telomerazy. Wykonano seryjne 5 x rozcieńczenia każdej próbki (przy maksymalnej liczbie komórek 20 000) w celu zapewnienia liniowości reakcji amplifikacji PCR. Eksperymenty powtarzano co najmniej dwa razy, z wyjątkiem kodonu 412 His / Tyr. Panel C pokazuje wyniki analizy koekspresji TERT typu dzikiego i TERT z mutacjami związanymi z niedokrwistością aplastyczną lub (w kodonie 441) polimorfizmem. Równe stężenia wektora ekspresyjnego TERT typu dzikiego i plazmidu, który zawierał indywidualną mutację (w stosunku 1: lub 1: 3, w oparciu o stężenie plazmidu w mikrogramach) kotransfekowano do linii komórkowej VA13 + TERC. W przypadku komórek eksprymujących kopię typu dzikiego genu TERT zastosowano łącznie 2 .g lub 4 .g DNA. Lizaty komórkowe przygotowano i testowano jak nakreślono dla Panelu B. Panel D pokazuje wyniki analizy Northern blot RNA TERT z komórek VA13 + TERC transfekowanych wektorem ekspresyjnym TERT wyrażającym sekwencję typu dzikiego lub różne mutacje związane z chorobą. Pusty wektor dotyczy lizatu komórkowego wytworzonego z komórek VA13 + TERC transfekowanych pustym wektorem pcl (tj. Wektorem pozbawionym ekspresji TERT).
Otrzymano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej od pacjentów i zdrowych członków rodziny niosących kodon 202 Ala / Thr i kodon 1090 mutacji Val / Met i zdrowych kontroli. Po ekspansji ponad 90 procent komórek było żywych, zgodnie z testem wykluczania barwników; na cytometrii przepływowej komórki były głównie komórkami T (CD4 + lub CD4-) i miały podobne szybkości proliferacji, jak określono za pomocą analizy cyklu komórkowego (dane nie pokazane)
[więcej w: złamanie nosa objawy, wyrostek haczykowaty, pochp zaostrzenie ]
[podobne: spiaczka cukrzycowa, grecki nos, spiaczka cukrzycowa objawy ]